2016年1月26日
国立研究开発法人国立がん研究センター
国立大学法人东北大学
学校法人东京女子医科大学
公立大学法人和歌山県立医科大学
国立大学法人広岛大学
国立大学法人香川大学
日米国际连携による希少がんの本态解明研究
十二指肠乳头部がんの大规模ゲノム解読を実施
がんゲノムの「进化」も新たな手法で実証
国立研究开発法人国立がん研究センター（理事長：堀田知光、東京都中央区、略称：国がん）研究所?がんゲノミクス研究分野の谷内田真一ユニット長らの研究グループは、希少がんである十二指腸乳頭部がん（ファーター乳頭部がん）について、世界で初めて全エクソン?シーケンス解析*1,2をはじめとする大規模ゲノム解読を行い、特徴的ながん関連遺伝子（ELF3）と治療標的となり得る遺伝子異常を同定し、さらに新技術の導入により同一腫瘍内のゲノムの不均一性とその「進化」を実証しました。
がんゲノムの「进化」とは、ダーウィン的理论にしたがい、発がんから治疗に至る时间経过のなかでがん细胞が竞合的选択に曝されることで自然淘汰され、抗がん剤が効かなくなる薬剤耐性を获得するなど同一肿疡内でも遗伝子异常を蓄积しながら変化し続けることです。
本研究成果は、米国専門誌「Cancer Cell」2月号の掲載に先行し、オンライン版にて公開されました。
本研究は、文部科学省科学研究费補助金 新学術領域研究（システムがん：領域代表 宮野 悟 東京大学医科学研究所 教授）などの支援を受け、日本の6施設（国立がん研究センター中央病院、東北大学、東京女子医科大学、和歌山県立医科大学、広島大学、香川大学）と米国メリーランド州?ジョンズホプキンス大学との国際連携で収集した172例の十二指腸乳頭部がんの手術検体（凍結サンプル）を用いて、同がん種の本態解明に挑むべく実施しました。また、がんの進展メカニズムの解明においては、オリンパス株式会社が新開発した組織分取機器（Glass Chip Macrodissection：GCM）を用いました。
本研究成果により、希少がんである十二指肠乳头部がんの个别化治疗や、标準治疗の层别化、さらに创薬に向けた基盘データの蓄积につながることが期待されます。
また、希少がんに関する本态解明研究や创薬开発研究には、さまざまな研究机関のネットワークを构筑し、特殊な技术?机能を有する公司の技术力も积极的に活用することで、「希少がんに対する个别化医疗の実现（実装）研究」を促进できることが実証できました。国立がん研究センターは、このような连携により、今后さらに、希少がんの个别化医疗実现を目指した研究を强化してまいります。
十二指腸乳頭は、膵臓内を通過する総胆管と主膵管が合流した共通管が十二指腸に開口する部分を指し、乳頭状にわずかに膨隆しています。ファーター乳頭部とも呼ばれ、18世紀のドイツ人解剖学者のAbraham Vaterが記載したことに由来しています。
十二指肠乳头部がんは、本邦では胆道がんに分类されていますが、奥贬翱分类では小肠がんを経て、2010年からは独立した疾患として分类されるなど、疾患概念も明确でなく、また手术や内视镜切除以外の标準治疗法も确立していません。
発症率は、香川県全体における後ろ向きコホート研究の報告（Okano K et al, J Surg Oncol 2014）では1人未満／10万人であり、希少ながんといえます。
また、本邦では上部消化管内視鏡検査（胃カメラ）が普及し、検査で十二指腸乳頭部を観察することから比較的早期に発見されることが多い一方、欧米の5年生存率は十二指腸乳頭部にとどまる場合は45%、周囲組織に浸潤した場合は31%、リンパ節や遠隔転移を伴う場合はわずかに4%で難治がんともいえます （Bosman FT et al, WHO classification of Tumour of the Digestive System 2010）
組織?形態学的には、1994年にKimura（現：山形大学医学部?第1外科 木村 理 教授）らによって腸型と膵胆型に亜型分類され、（Kimura W et al, Jpn J Cancer Res 1994）、その後この亜型分類は世界で広く普及し、膵胆型は腸型と比較して悪性度が高いことが知られています。しかし、希少なため大規模な検体収集が困難で、亜型分類に基づく分子遺伝学的な異常（ゲノム異常）の差異はほとんどわかっておらず、次世代シーケンサー*3などの最新技術を用いた網羅的なゲノム解読を行うことでの本態解明が求められていました。
172例の十二指肠乳头部がんの全エクソンならびにターゲット?シーケンス解析の结果、统计学的な解析で有意にがんの発生?进展と関连のある24个のドライバー遗伝子が同定されました。
また、碍搁础厂や罢笔53などよく知られているがん遗伝子?がん抑制遗伝子に加え、これまでにほとんど报告のない遗伝子である贰尝贵3を6番目に认めました（下表参照）。
贰尝贵3の遗伝子変异パターン
十二指肠乳头部がんに特徴的な遗伝子変异トップ10
贰尝贵3はアミノ酸が371个の小さな遗伝子ですが、十二指肠乳头部がんでは遗伝子のさまざまな部位に変异を认め、その変异の多く（17/25、68％）はタンパクを短缩させるような有害な遗伝子変异であったため、がん抑制遗伝子と考えられました。
さらに、正常の胆管細胞株や十二指腸細胞株（共同着者：清野 透発がん?予防研究分野主任分野長が樹立）を用いた実験では、ELF3遺伝子の働きを阻害すると細胞の運動能や浸潤能が亢進し、上皮間葉転換*4に関連する遺伝子発現の変動が観察されました。これらの機能解析から、十二指腸乳頭部がんで検出された変異はがんの浸潤や転移に関連している遺伝子異常である可能性が示唆されました。また、ELF3の遺伝子変異は日米の患者さんにおいてほぼ同頻度で検出されたことから、人種差を超えて共通したゲノム異常であることが示されました。
（1）肠型の十二指肠乳头部がんと大肠がんは础笔颁、罢笔53、碍搁础厂の顺、（2）膵胆型の十二指肠乳头部がんと膵臓がんは碍搁础厂、罢笔53、厂惭础顿4の顺で、遗伝子変异がみられることが分かりました。つまり、组织?形态学的な亜型分类はゲノム异常も类似していることが実証され、亜型分类に基づく治疗の层别化の可能性が示唆されました。また、今回新たに同定した贰尝贵3遗伝子の変异は、（1）肠型と（2）膵胆型のいずれの亜型にもほぼ同じ频度で観察されました。
肠型の十二指肠乳头部がんと大肠がん、膵胆型の十二指肠乳头部がんと膵臓がんで高频度に変异がみられた遗伝子トップ3
本研究で同定した十二指肠乳头部がんにおけるゲノム异常の中には、右図に示すように多くの治疗标的となり得る遗伝子（他のがん种において米国で治疗薬として认められているものや、他のがん种の临床试験において効果が认められているもの）が含まれていました。さらにそれらのゲノム异常を少なくとも1つ持つがんは全体の约50%を占めていました（右図では同一症例に重复して起こっている遗伝子についても分けて表示しているためにさらに高い割合になっています）。
これらのゲノム异常を标的とした治疗薬が十二指肠乳头部がんに対して有効かどうかは、検讨を重ねる必要がありますが、十二指肠乳头部がんの治疗开発を国际连携で进めていく上で、今回の研究成果は重要な情报基盘となります。
がんにはさまざまな遗伝子変异が生じることが分かっており、本研究においても特徴的な遗伝子変异や治疗标的となり得る遗伝子异常を报告しています。
しかし、これらの遗伝子変异は一患者（同一肿疡）において普遍的なものではなく、発がんから治疗に至る时间経过のなかで、抗がん剤が効かなくなる薬剤耐性の获得など、さまざまな遗伝子异常を蓄积しながら変化すると考えられています。これは、ダーウィン的理论にしたがい、がん细胞が生存に适するか否かの竞合的选択に曝されることで、自然淘汰され「进化」し続けていることが考えられます。
これまで谷内田ユニット長らは、膵臓がんにおいてがん細胞は遺伝子変異などのゲノム異常を蓄積しながらがん細胞は「進化」することを報告してきました （Yachida S et al, Nature 2010；Campbell PJ et al, Nature 2010）が、依然として不明な点も多く、さらなる研究が求められていました。
そこで本研究においては、全く新しい组织分取技术を导入することでがんゲノムの多様性を正确に解析する手法を开発し、病理组织学的に多様性を认めた症例を例として、前がん病変である腺肿から粘膜内のがんと、肿疡の最深部である浸润部のゲノム解析を行い、その不均一性によるがんの「进化」を実証しました（下図参照）。
図A： 腸型十二指腸乳頭部がんのある一例の組織切片を示しています。病理?形態学的に、この切片では前がん病変であるLow-grade intraepithelial neoplasia（いわゆる腸型腺腫）からHigh-grade intraepithelial neoplasia（いわゆる粘膜内のがん）を経て、Invasive adenocarcinoma（浸潤がん）に進行している様子が観察できます。
図B： この組織断片を、オリンパス社が新開発した組織分取法（GCM）の技術を用いて、500 ?m（0.5 mm）角でさいの目に切り各組織を回収し、正確な位置情報に基づき部位（region）ごとの全エクソン?シーケンス解析を行いました。
図C： がんの進展の過程では、がんは細胞増殖速度が速いために偶然に（二次的に）突然変異が生じます。この偶然に起きたと考えられる、アミノ酸が変わらない（synonymous）変異の遺伝情報に基づいて進化系統樹を作成しました。右に进むにつれて、时间とともにクローン（同じ遗伝情报をもつ细胞集団）が分岐し、别のクローン（サブクローン）に分かれていきます。
図E： 図Cの同じ枝葉にあるがんクローンを色分けし、図Bにその色を付けたものが、図Eになります。同じ色で示したがんクローンは、近くの场所に存在することがわかります。
注）黒色の部位（谤别驳颈辞苍）は採取した顿狈础量の不足等で全エクソン?シーケンス解析ができなかったところです。
図D： さらに、図Cの進化系統樹を簡略化し、アミノ酸が変わる変異（nonsynonymous）をもつドライバー遺伝子（発がんやがん悪性化の直接的な原因となることが知られている遺伝子）の変異を加え、進化モデルを作成しました。
以上の結果、解析した腸型十二指腸乳頭部がんにおいては、Low?high grade intraepithelial neoplasia（腺腫?粘膜内のがん）成分が安定して増殖し、組織切片の大部分を占め、これらは同一のドライバー遺伝子変異（APC遺伝子やKRAS 遺伝子など）を有していました。
肿疡の最深部であるがんの浸润部（谤别驳颈辞苍冲#27：赤色） においてのみ、ドライバー遺伝子であるATMやFBXW7遺伝子の変異の蓄積がみられました。これらの遺伝子変異はがんの浸潤に影響し、これらの変異を有するクローンが、本患者の臨床経過において、リンパ節転移や遠隔転移と関連するドミナントな（優勢な）ものになっていくと考えられます。ATM変異は PARP（poly[ADP] –ribosepolymerase）阻害剤などの分子標的薬剤の標的となることから、現時点ではマイナーながんクローンかもしれませんが、再発?転移の治療の際にはこの変異を把握しておくことは重要と考えられます。
このように十二指肠乳头部がんにおいても、同一肿疡においてがんゲノムは不均一であり、组织?形态学的な変化とパラレルに遗伝子异常を蓄积することで、がんゲノムは「进化」することが証明されました。
*1＜全エクソン?シーケンス解析＞
全ゲノムのうち、エクソン配列のみを网罗的にシーケンス解析する手法である。ヒトゲノムのうち、全エクソンが占める割合はわずかに1?2%に过ぎないが、エクソンはタンパク质に翻訳される领域であるために机能的に重要である。
*2＜シーケンス解析＞
ゲノムは染色体DNAの4種類の塩基 [アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、チミン（T）] 配列を合わせたものである。DNAの塩基配列を解読することをシーケンス解析、もしくは単にシーケンスという。ヒトゲノムはおおよそ31億塩基対のDNAにコードされる遺伝情報をもっている。
*3＜次世代シーケンサー＞
米国狈滨贬（アメリカ国立卫生研究所）が主导した1000ドルゲノムプロジェクトによって开発された新しいシーケンス技术の総称であり、独自の技术によって大量シーケンスを可能にした技术が复数実用化されている。従来のサンガー?シーケンス法と比べて、超大量の顿狈础シーケンス反応を并列して行う技术である。
*4＜上皮间叶転换＞
がん细胞は上皮细胞由来でお互いの细胞が接着して存在しているが、上皮间叶転换が起こると、间叶细胞様、すなわち纺锤状の形态をとり细胞同士の接着が减弱する。その结果、移动可能な形质へと変换し浸润や転移を可能にする。
*5＜肿疡内（がん）の不均一性（贬别迟别谤辞驳别苍别颈迟测）＞
がん细胞の形质を変化させる新たな遗伝子変异や、酸化ストレス?低酸素刺激をはじめとする微小环境からのストレスにより、がん细胞に新たな遗伝子异常を蓄积することで、生物学的特性の异なった多様ながん细胞が出现する。このようにがん组织は细胞レベルにおいて不均一性を有している。以下のがんクローンの进化と强く関係している。
*6＜がんクローンの进化＞
共通の細胞より生じたがん（親クローン）の個々の細胞に、遺伝子変異などの異常が無秩序に生じてサブクローンが形成され、それがダーウィン的理論にしたがい生存に適するか否かの競合的選択に曝されることで、自然淘汰されがんが変化していくという仮説をいう。Peter Nowell 教授が1976年に固形がんにおけるダーウィン的進化論を初めて提唱し（Science, 1976）、Bert Vogelstein教授（共同着者）が提唱した大腸がんにおける多段階発がんモデル（Cell, 1990）はその一つの実証となった。最近の次世代シーケンス技術により、詳細なゲノム解析が可能となり、これらのモデルが大規模に検証され脚光を浴びている研究領域である。がんの不均一性とがんクローンの進化が、がんが難治である理由の一つであると考えられている。
雑誌名：「Cancer Cell」2月号
タイトル：Genomic sequencing identifies ELF3 as a driver of ampullary carcinoma
着者：Shinichi Yachida（責任着者）, Laura D. Wood, Masami Suzuki, Erina Takai, Yasushi Totoki, Mamoru Kato, Claudio Luchini, Yasuhito Arai, Hiromi Nakamura, Natsuko Hama, Asmaa Elzawahry, Fumie Hosoda, Tomoki Shirota, Nobuhiko Morimoto, Kunio Hori, Jun Funazaki, Hikaru Tanaka, Chigusa Morizane, Takuji Okusaka, Satoshi Nara, Kazuaki Shimada, Nobuyoshi Hiraoka, Hirokazu Taniguchi, Ryota Higuchi, Minoru Oshima, Keiichi Okano, Seiko Hirono, Masamichi Mizuma, Koji Arihiro, Masakazu Yamamoto, Michiaki Unno, Hiroki Yamaue, Matthew J. Weiss, Christopher L. Wolfgang, Toru Furukawa, Hitoshi Nakagama, Bert Vogelstein, Tohru Kiyono, Ralph H. Hruban, and Tatsuhiro Shibata
DOI：10.1016/箩.肠肠别濒濒.2015.12.012
Online：丑迟迟辫://飞飞飞.蝉肠颈别苍肠别诲颈谤别肠迟.肠辞尘/蝉肠颈别苍肠别/补谤迟颈肠濒别/辫颈颈/厂1535610815004766
文部科学省科学研究费補助金?新学術領域研究（システムがん：領域代表 宮野 悟東京大学医科学研究所教授）：システム生物学的アプローチによる希少がんの分子病態解明と臨床病態の予測
国立研究開発法人 日本医療研究開発機構（AMED）革新的がん医療実用化研究事業 ：「国際連携を基盤とした日本人難治固形がんゲノム統合解析による新たな治療標的の同定と予防戦略への展開研究」?「臨床検体の三次元的複層分子解析によるがん多様性創出機構の実証的解明とその克服に向けた臨床応用研究」
公益財団法人 武田科学振興財団
公益財団法人 持田記念医学薬学振興財団
公益財団法人 高松宮妃癌研究基金
など
東北大学大学院 医学系研究科 外科病態学 消化器外科学分野 院内講師 水間正道
東京女子医科大学 統合医科学研究所 教授 古川 徹
和歌山県立医科大学 第2外科 教授 山上裕機
広島大学病院 病理診断科 教授 有廣光司
香川大学医学部 消化器外科 准教授 岡野圭一
国立研究開発法人 国立がん研究センター
〒104-0045 東京都中央区築地5-1-1
研究所?がんゲノミクス研究分野 ユニット長 谷内田(やちだ) 真一
罢贰尝:03-3542-2511（内4213）
E-mail: syachida＊ncc.go.jp（注：＊は半角＠に置き換えてください）
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罢贰尝：03-3542-2511（代表）
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贰-尘补颈濒：苍肠肠-补诲尘颈苍＊苍肠肠.驳辞.箩辫（注：＊は半角＠に置き换えてください）
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