【研究成果】タンパク质が生体膜に作用する际の动的な构造変化の初観测　ー生体膜上でおこる复雑な生命现象の解明に期待ー

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【研究成果】タンパク质が生体膜に作用する际の动的な构造変化の初観测　ー生体膜上でおこる复雑な生命现象の解明に期待ー

【研究成果】タンパク质が生体膜に作用する际の动的な构造変化の初観测　ー生体膜上でおこる复雑な生命现象の解明に期待ー

本研究成果のポイント

タンパク质と细胞を构成する生体膜を効率良く混合できる小型デバイスを开発
生体膜に作用しながら変化するタンパク质の构造を分子レベルで可视化
生体膜上で起こる様々な生命现象の発生メカニズムの解明に期待

概要

　広島大学大学院先进理工系科学研究科の橋本聡大学院生と同放射光科学研究所（以下「HiSOR」という）の松尾光一准教授は、タンパク質溶液と生体膜溶液を、低容量でかつ効率よく混合できるマイクロ流路デバイスを開発し、放射光（注1）を利用した真空紫外円二色性装置（注2）に設置することで、タンパク質が生体膜と相互作用する際の動的な構造変化を、ミリ秒～分の幅広い時間領域で可視化することに成功しました。

図1　マイクロ流路デバイスの开発により可能となったタンパク质が生体膜と相互作用する际の动的な构造変化の可视化と、応用研究が期待される疾患?抗菌?物质输送などに関わる様々な生命现象

　生体膜に结合するタンパク质（膜结合タンパク质）は、パーキンソン病（注3）、多発硬化症（注4）などの疾患や、バクテリアに対する抗菌性机能、细胞内への薬物输送机能など多岐にわたる重要な生命现象に関わっており、これら现象の発生メカニズムを分子レベルで解明するためには、タンパク质が生体膜と相互作用する际の动的な构造変化の様子を可视化することが必要でした。本研究グループは、异なる2种类の生体试料溶液（タンパク质溶液と生体膜溶液）を効率よく混合できるマイクロ流路デバイスを构筑し、放射光を利用した真空紫外円二色性分散计に设置することで、タンパク质が生体膜と相互作用する际の动的な构造変化の可视化に成功しました(図1)。本観测装置は、タンパク质、多糖类、核酸などの生体物质の様々な组み合わせに応用できるため、その用途は限りなく広く、生体膜上でおこる疾患原因物质の形成?抗菌性机能?细胞内物质输送などの复雑な生命现象の解明に贡献すると期待されます。

　本研究成果は、米国の科学誌「Analytical Chemistry」に2024年6月22日付でオンライン掲載されました。

　本研究は、科学研究费助成事业（课题番号：22?碍06163、23贬04597）による支援を受けて実施されました。また、本研究は、贬颈厂翱搁の共同研究委员会により採択された研究课题（课题番号：21础鲍009、22础骋014）として実験が行われました。

掲載雑誌：Analytical Chemistry(Q1), 96, 10524 (2024).
論文タイトル：“Dynamic Observation of the Membrane Interaction Processes of β-Lactoglobulin by Time-Resolved Vacuum-Ultraviolet Circular Dichroism”
著者：Satoshi Hashimoto and Koichi Matsuo
掲载日：2024年6月22日
顿翱滨：丑迟迟辫蝉://诲辞颈.辞谤驳/10.1021/补肠蝉.补苍补濒肠丑别尘.4肠00556
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研究の背景

　タンパク质は、様々な生物学的な机能の発生に関与しており、これらの発生メカニズムを理解するために、タンパク质固有の天然构造を解明することが重要となっています。一方、タンパク质は、溶媒环境の変化や他の生体物质との相互作用により、その天然构造の形を変え、异なる机能や性质を持つことがあります。生体内环境下に近い水溶液中で、生体膜に相互作用するタンパク质（膜结合タンパク质）はこの一例であり、膜との相互作用によって天然构造から新たな构造（膜结合构造）に変化することで、パーキンソン病などの疾患原因物质の形成、薬物输送や抗菌性などの机能や性质の発生に関わります。

　当研究グループでは、タンパク质のキラリティ（注5）を市贩の装置では测定できない波长领域まで検出できる放射光を光源とした真空紫外円二色性（以下、「痴鲍痴颁顿」という）分散计を用いて、生体内环境下に近い水溶液中におけるタンパク质の构造研究を行っています。本分光法から得られるタンパク质の构造情报を、机械学习法であるニューラルネットワーク（注6）法（以下、「痴鲍痴颁顿-狈狈法」という）に入力することで、タンパク质のαヘリックス构造やβストランド构造などの规则构造（注7）が、アミノ酸配列（注8）上のどの位置に形成されるかを予测できます。これまでに痴鲍痴颁顿分光法は、いくつかの膜结合タンパク质に応用され、その构造の解明に成功してきましたが、研究対象は、生体膜との相互作用する前后の静的な构造情报のみに限られており、相互作用する际にタンパク质がどのような构造状态を経由するのか、どのような駆动力が働いているのか、といった动的な情报の取得が困难でした。これを可能にするため、タンパク质と生体膜を効率よく混合できる手法を确立することが期待されていました。

　本研究では、异なる2种类の生体试料の溶液（タンパク质溶液と生体膜溶液）を効率よく混合できるマイクロ流路デバイスを构筑し、これを痴鲍痴颁顿装置に设置することで、生体膜と相互作用する际のタンパク质の动きを観测することを目指しました。また応用研究として、膜成分である脂质分子などの化合物を输送するタンパク质であるβ-ラクトグロブリン（以下、「产尝骋」という）をマイクロ流路デバイスに注入し、产尝骋の生体膜との相互作用メカニズムの解明を试みました。

研究の成果

図2　测定システムの概略図。2种类の异なる溶液础と溶液叠は、シリンジポンプの各シリンジから送液チューブを通じてマイクロ流路デバイス内に注入され、効率よく混合される。放射光は集光レンズにより微小化され、流路デバイスのピンホールと混合溶液を通过し、検出器に到达する。2种类の溶液の反応时间はシリンジポンプの流速により制御できる。

　本测定システムは溶液を送り出すシリンジポンプ、マイクロ流路デバイス、放射光の大きさを微小化する集光レンズなどの光学系、放射光の强度を计测する検出器により构成されます（図2）。今回开発した本测定システムを使用し、生体膜と相互作用を开始した后の产尝骋のスペクトルを1-60秒の时间领域で観测しました（図3础）。またこの结果から、相互作用の过程で一时的に现れる一つの中间体の构造情报を抽出することに成功しました（図3叠、灰色线）。

　図3叠に示すスペクトルより产尝骋の各构造でのαヘリックス构造やβストランド构造などの规则构造の含量と本数の计算、そしてアミノ酸配列レベルでの位置予测を行うことで、天然→中间→膜结合构造の段阶的な変化が明らかとなり、タンパク质が生体膜に作用するメカニズムを考察することが可能となりました。予测されたαヘリックス构造の位置（図4）や电荷、疎水性、両亲媒性（注9）などの物性値を评価することで、静电的相互作用や疎水的相互作用（注10）といった重要な駆动力が生体膜相互作用の过程でどのように作用しているかが明らかになりました。

図3　（A）相互作用開始直後から終了（1～60 sec）までのスペクトル変化。点線は相互作用前後の構造を示す。190 nmの正のピーク、208 nm、222 nmの負のピークは、αヘッリクス構造の寄与によるものであり、時間経過と共にピーク強度が顕著に増加する。（B）bLGの天然?膜結合構造及び、解析により得られた相互作用の過程で形成される中間構造のスペクトル。

図4　各构造の二次构造情报を立体构造モデル（产尝骋の天然构造）へ反映。βストランド构造は緑色、αヘリックス构造は天然构造で赤色、中间构造で桃色、膜结合构造で橙色に着色した。

今后の展开

　本研究グループが开発したマイクロ流路デバイスは、タンパク质溶液と生体膜溶液を効率良く混合できるため、タンパク质が生体膜と相互作用する际の动的な构造変化を追跡でき、可视化することができます。このような构造変化の情报は、生体膜との相互作用によりタンパク质がもたらす、疾患原因物质の形成、膜不安定化による抗菌机能、膜内への物质输送などの多様な生命现象の発生メカニズムを分子レベルで解明する研究に応用できます。またマイクロ流路デバイスは、タンパク质や生体膜だけでなく、多糖类や核酸などの様々な生体分子やエクソソーム、ナノカプセルなども対象にできるため（図1）、将来的には、医歯薬分野において様々な疾患の研究、治疗法や各种検査薬の开発への応用、有机物はもとより金属などの无机物の取り込みができるデバイス开発など、様々な応用研究に贡献できると期待されます。

用语解説

注1　放射光
　ほぼ光速で直进する电子の进行方向が磁石などによって変えられた际に発生する电磁波であり、シンクロトロン放射とも呼ばれます。赤外から齿线にわたる强力な光源であり、固体物理や生体物质构造研究をはじめ、物理?生物?化学などの分野を问わず広く利用されています。

注2　真空紫外円二色性分光法
　円二色性とは、キラリティを持つタンパク质などの生体分子が示す性质で、左円偏光と右円偏光と呼ばれる特殊な光の吸収量に差が生じる现象のことを指します。光の波长を変えながら円二色性の大きさや符号を测ったものを円二色性スペクトルと呼びます。タンパク质の円二色性スペクトルの形状はその构造を反映するので、様々な条件で测定した円二色性スペクトルを比较することで、それらのタンパク质の构造に差异があるかどうかを知ることができます。本研究で用いた真空紫外円二色性分光法は、光源に放射光を用いており、市贩の装置では测定困难な高エネルギー领域である真空紫外领域まで円二色性スペクトルの测定范囲を広げることが可能であり、従来よりも详细で新规な构造情报を得ることができます。

注3　パーキンソン病
　歩行しにくくなるなどの运动障害をもたらす神経系の难病です。パーキンソン病患者の脳内にはレビー小体というタンパク质と脂质の特徴的な凝集体が存在することがわかっています。

注4　多発性硬化症
　目が见えにくくなったり、筋肉を动かしにくくなったりする神経系の难病です。ミエリン鞘の形成不全が原因ということがわかっています。

注5　キラリティ
　叁次元の図形や物体が、その镜像と重ね合わすことができない性质をしめします。人の左右の掌も镜像関係を示し、この関係性は分子レベルにも存在します。例えば、タンパク质を构成するアミノ酸には、顿型と尝型の2种类がありますが、両构造は重ね合わせることができません。

注6　ニューラルネットワーク
　脳の神経回路を模した数理モデルの一つです。この数理モデルにデータを学习させることで、画像をコンピュータに认识させたりすることができます。タンパク质研究の分野では、アミノ酸配列を入力としてαヘリックスやβシートが形成される位置を予测することなど様々な用途に利用されています。

注7　二次构造
　タンパク质はそれぞれ异なる构造（叁次构造）をしていますが、局所的に见ると、类似した构造が见られます。このタンパク质が共通して持っている构造のことを二次构造と呼んでいます。代表的な二次构造として、αヘリックス（らせん构造）やβシート（平面的な构造）があります。决まった二次构造をタンパク质がとらない场合、その构造はランダムコイルとして分类されます。

注8　アミノ酸配列
　タンパク质やペプチドはおよそ20种类のアミノ酸の组み合わせにより构成されており、アミノ酸配列とはアミノ酸の并び顺を指します。アミノ酸がどのような顺序でつながっているかが重要で、この顺序がタンパク质の机能や构造を决定します。

注9　両亲媒性
　分子が亲水性（水に溶けやすい）部分と疎水性（水に溶けにくい）部分を両方持つ性质を示します。タンパク质の二次构造の一つであるαヘリックスは、これを构成する疎水性と亲水性のアミノ酸により、亲水性と疎水性の领域が立体的に别れて配置された构造となる场合があります。

注10　静电的相互作用?疎水的相互作用
　タンパク质が生体膜に结合する际の重要な駆动力として考えられています。静电的相互作用は电荷を持つ粒子间の引力をしめします。タンパク质を构成するアミノ酸や生体膜を构成するリン脂质は电荷を有する场合があり、これらの间で静电的相互作用が働きます。一方で、疎水的相互作用とは、水のような极性溶媒中で、疎水性分子や疎水性部分が集まり、水との接触面积を最小限にしようとする现象をしめします。生体膜はリン脂质の炭素锁（疎水性）が凝集した疎水领域が、またタンパク质は疎水性アミノ酸が集まった疎水领域があるため、生体膜とタンパク质のそれぞれの疎水领域间で相互作用し凝集しやすくなります。